CRISPR-Cas9, des ciseaux à ADN révolutionnaires en génie génétique

Éliminer les maladies génétiques, créer de nouveaux médicaments, modifier l’ADN d’un embryon, Crispr-Cas9 pourrait bien rendre tout cela possible…

Toutes nos cellules contiennent de l’ADN

Pour rappel, l’ADN est une double hélice composée d’une séquence bien définie de bases azotées (A,C, G,T) qui contient l’information génétique.   L’ADN est transcrit en ARN (une séquence avec un brin) qui est ensuite traduit en protéines.

Les séquences de ces bases azotés forment un code. L’ADN code pour des gènes. Les gènes (portions d’ADN) définissent qui nous sommes (couleur des yeux, des cheveux, synthèse protéique, etc…). La modification de gènes dans des cellules vivantes est difficile.

adn support information genetique code base azote nucleotides sequences

jennifer doudna Emmanuelle Carpentier prix Breakthrough Prize FoundationLes mécanismes biologiques de CRISPR-Cas9 ont été révélés en 2012 dans Sciences (revue internationale scientifique) par Jennifer Doudna de l’Université de Californie et Emmanuelle Charpentier de l’Institut Max Planck des infections biologiques à Berlin, mais Feng Zhang du MIT a eu les droits du brevet.  Ces 2 femmes ont reçu de nombreux prix dont le Breakthrough Prize Foundation, le prix L’Oréal-Unesco pour les femmes et la science. Certains pensent également au prix Nobel à venir…

Le fonctionnement de CRISPR-Cas9

Il y a quelques années, des chercheurs avaient découvert que les bactéries ont également une sorte de système immunitaire adaptatif (mémoire immunitaire). Les bactéries peuvent se faire attaquer par des virus comme les bactériophages.  Après une attaque d’un virus, la bactérie va stocker des informations sur cet ADN viral dans les « spacers » : les régions CRISPR (courtes répétitions palindromiques regroupées et régulièrement inter-espacées) contiennent une alternance de courtes séquences répétées et de séquences « spacers ». Ces spacers sont de l’ADN étranger intégré par l’hôte. Ces séquences CRISPR sont également retrouvées chez les Archées (autre branche du monde du vivant).

CRISPR mecanisme biologique foncitonnement spacers

Si la bactérie est de nouveau attaquée par ce même virus, elle va créer un ARN guide (gRNA) qui correspond à l’ADN du virus. L’enzyme Cas9 va intégrer cette ARN qui va la guider jusqu’à l’ADN viral à couper. Le découpage de cet ADN viral commencera lorsque Cas9 trouve un site PAM. La protéine Cas9 se fixe sur l’ADN cible et effectue une cassure double brin de l’ADN. Le découpage de l’ADN viral entraînera la mort du virus. La protéine Cas9 fait partie de la famille des nucléases, qui agissent comme des ciseaux sur l’ADN. Les chercheurs ont découvert que ce système peut couper l’ADN viral, mais également toutes les séquences d’ADN à un lieu précis. Le lieu de coupure repose sur la spécificité de la complémentarité des bases entre l’ARN guide et l’ADN cible.

genome edition crispr cas9

Il suffit donc d’un ARN guide pour que le système CRISPR-Cas9 coupe l’ADN à un endroit ciblé. Après que l’ADN soit coupé, cette cassure est réparée par recombinaison homologue ou jonction d’extrémités non homologues (NHEJ). La recombinaison homologue consiste en un échange de séquences de nucléotides entre deux molécules d’ADN identiques (entre le chromosome endommagé et le chromosome homologue intact).  La NHEJ consiste à simplement ressouder les deux brins d’ADN séparés.

Si vous n’avez pas tout compris, n’hésitez pas à regarder cette excellente vidéo (en anglais) :

Autres techniques de modifications de l’ADN :

  • méganuclease ciseau ADN modification genetique
    Représentation 3D de méganucléase

    Les méganucléase reconnaissent de très longues séquences d’ADN (>12 paires de bases). En s’attachant à l’ADN cible, elle provoque une cassure double-brin de l’ADN. Il en existe 3 types : les méganucléases introniques, codées par des gènes indépendants ou intéines.

  • Les nucléases à doigts de zinc (Zinc Finger nucleases) sont des protéines hybrides résultant de la fusion de gènes codant les protéines à doigts de zinc (qui reconnaît une séquence d’ADN définie : 3 nucléotides spécifiques) et d’une enzyme de restriction Fok I (qui va couper l’ADN). Fok I a été isolée de la bactérie Flavobacterium okeanokoites.  Les protéines à doigt de zinc sont connues depuis 25 ans.
  • Les effecteurs transactivateurs (TALENs = transcription activator-like effector nucleases) sont des enzymes artificielles avec un domaine TAL effectors (qui reconnaissent une séquence d’ADN spécifique) et un domaine catalytique qui va couper l’ADN . Ces TAL effectors proviennent de la bactérie Xanthomonas.

L’avantage de la technique CRISPR-Cas9 est sa simplicité de mise en œuvre, son faible coût. La reconnaissance spécifique repose sur un ribonucléotide (gRNA) alors que pour les autres techniques, elle repose sur le complexe protéine-ADN reconnu. Cette ARN guide (gRNA) est simple à fabriquer. L’ARN guide et l’ARN codant la protéine Cas9 peuvent être introduits directement dans des embryons de souris par exemple.

modification adn nuclease talens crispr-cas9 comparaison

Les utilisations en thérapie génique

La thérapie génique consiste à manipuler les gènes afin de traiter une maladie. La technique CRISPR-Cas9 peut être utilisée pour insérer, retirer ou inhiber des gènes. Cette technique pourrait permettre de traiter les maladies liées à une mutation d’un gène particulier comme :

  • la mucoviscidose est une maladie qui touche les voies respiratoires. Son origine est la mutation du gène CFTR sur le chromosome 7.
  • l’hémophilie est une pathologie qui empêche le sang de coaguler. L’origine est une mutation sur le chromosome X qui code un facteur de coagulation.

Ils ont également découvert que injecter CRISPR-Cas9 dans une bactérie avec un bactériophage fait mourir la bactérie : cela pourrait être utilisé comme une alternative aux antibiotiques.

Des problèmes éthiques et de sécurité

Une équipe chinoise a été sous le feu de critiques après avoir testé cette technologie sur des embryons humains dans cette étude publiée dans Protein Cell. Les embryons utilisés n’étaient pas viables puisqu’ils avaient des chromosomes en surnombre suite à deux fertilisations in vitro. L’équipe voulait modifier le gène responsable de la β-thalassémie une forme d’anémie suite à la malformation des globules rouges (absence de chaîne béta de l’hémoglobine).

Ils ont donc utilisé cette technologie sur 86 embryons. Seulement 28 se sont bien divisés en conservant le remplacement de matériel génétique. Huang a conclu  « si vous voulez le faire sur des embryons, cette technologie doit fonctionner à 100%. C’est pourquoi nous avons arrêté. Nous pensons que CRISPR-Cas9 est encore trop immature. »

Un autre détail gênant est qu’ils ont également découvert l’apparition de mutations inattendues suite à l’introduction de CRISPR-Cas9 : l’enzyme a pu éditer du génome non ciblé par les chercheurs au départ. Cette publication avait été rejetée par Nature et Science pour raisons éthiques. Théoriquement cette technique pourrait être appliqué aux cellules reproductices : les modifications génétiques de l’embryon sont transmises à toute sa descendance, ce qui pourrait ouvrir les portes à l’eugénisme. « Une réglementation claire est nécessaire pour la sécurité de tous. On ne peut en effet pas permettre que les gens l’utilisent pour  « créer l’enfant parfait » déclarait Jennifer Doudna. Elle ajoute : « Ma plus grande crainte est que quelqu’un ne veuille être le plus rapide, et que cette technique, dans ses applications, ne devienne dangereuse. Si cela était le cas, cela pourrait mener à une interdiction pure et simple du CRISPR-cas9, et des années de recherches seraient ainsi  réduites à néant . »

CRISPR-Cas9 est donc un formidable outil en génie génétique, mais il doit être encadré pour éviter les dérives d’utilisations. Sur cette carte de Nature, on peut voir que les législations en matière de manipulations génétiques sur des embryons humains diffèrent :

En France, depuis 2013, la recherche sur les embryons humains est autorisée sous certaines conditions comme « la pertinence scientifique de la recherche » ou la « finalité médicale » (LOI n° 2013-715 du 6 août 2013 tendant à modifier la loi n° 2011-814 du 7 juillet 2011 relative à la bioéthique en autorisant sous certaines conditions la recherche sur l’embryon et les cellules souches embryonnaires ).

1- Aux États-Unis, les financements fédéraux ne peuvent pas être utilisés pour modifier des embryons humains, mais il n’y a pas d’interdictions claires pour l’édition du génome.

2- En Argentine, le clonage humain est interdit, mais la législation sur l’édition du génome n’est pas claire.

3- Au Royaume-Uni, depuis 2009, la recherche fondamentale sur les embryons humains est autorisée, mais elle reste interdite pour la recherche clinique.

4- En Allemagne, la recherche est très limitée et réglementée pour manipuler des embryons humains.

5- Au Japon, en Inde et en Chine, l’édition du génome humain d’un embryon est interdite.

carte regulation genetique humaine embryon modification

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Source:

Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E –  A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity – Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21. doi: 10.1126/science.1225829 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22745249

Liang P. et al. – CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes – Protein Cell. 2015 May;6(5):363-72 .http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25894090

Jim Yeadon, Ph.D – Pros and cons of ZNFs, TALENs, and CRISPR/Cas – https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2014/march/pros-and-cons-of-znfs-talens-and-crispr-cas

CNRS – Lésions de l’ADN : une réparation adaptée dans l’espace http://www.cnrs.fr/insb/recherche/parutions/articles2014/e.soutoglou.html

http://www.ieb-eib.org/fr/bulletins/docteur-honoris-causa-a-la-kuleuven-et-mise-en-garde-a-propos-du-crispr-cas9-363.html

Le Cong, F. Ann Ran – Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems – Science. 2013 Feb 15; 339(6121): 819–823. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3795411/

Sante Cruz Biotechnology – CRISPR SYSTEMS http://www.scbt.com/fr/crispr-cas9_system.html

Les proteins Doigts de Zinc http://ipubli-inserm.inist.fr/bitstream/handle/10608/6009/MS_2007_10_834.html*

Tina Hesman Saey (2015) – Year in review: Breakthrough gene editor sparks ethics debate – ScienceNews https://www.sciencenews.org/article/year-review-breakthrough-gene-editor-sparks-ethics-debate

 

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